转染效率低的话可以从三个方面改善,首先要确保细胞状态是好的,通常我们选出处于分裂期的细胞,另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒,还有就是dna的质量尤为重要,最好是先酶切验证。
这个实验检测结果很灵敏,有一定差异是正常的,通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从以下两方面改善:
1、细胞裂解后建议离心取上清,保证样本的均一性;
2、保证加样的准确性,移液器需定期校准,确保移液精准。
1. 启动子活性低
a.优化细胞的培养条件,提高荧光素酶的表达量;
b.更换强启动子(如sv40、cmv)。
2. 转染效率低
a.优化转染实验条件,用较易转染的质粒做阳性对照(如转染过表达荧光蛋白质粒);
b.确保转染dna的质量,可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对dna质量进行鉴定;
c.选择活性较高,处于指数分裂期的细胞进行转染。
3. 样品裂解效率低
a.细胞培养时间不宜过长,12-36h内最好,长时间培养后,细胞可能会难裂解;
b.加入的裂解液需足量,保证细胞能够充分裂解。
4. 检测过程操作不规范
a. 选择合适的检测仪器,如luminometer 发光计、多功能酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验;
b.需加入足量底物,保证底物的饱和,否则会造成检测结果出现很大偏差;
c.室温反应。酶促反应对温度较为敏感,反应时各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温(20-25℃)再使用;
d.荧光素酶的半衰期一般约30min,加完底物后可立即检测,尽量在30min内完成;
e. 检测板:为防止孔间干扰,推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用,但因黑色会吸收光信号,可能会降低信号。
5. 底物氧化失效
a.底物避光密封保存,萤火虫荧光素酶底物-20℃保存;海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存;
b. 反应工作液建议现用现配。
可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性:
1. 对照的2个实验组,即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异;
2. 转染正常,质粒或mimic确保成功转染入细胞;
3. luc检测值在仪器检测线性范围内。
1. 如转入的mirna带荧光标记如gfp,则可直接在转染后、细胞裂解前,显微镜下观察细胞荧光;
2. 如转入的mirna不带任何荧光标记,可考虑进行mirna的qrt-pcr检测,通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组mirna有显著过表达;
3.设置一个荧光质粒转染参照组,同批转染一个组的细胞,间接反映出同批次实验的转染情况。
luciferase的灵敏度相比于gfp提高10-100倍以上,同时具有更宽的动态范围,便于数值分析比较,不需要荧光显微镜,而且在活体实验中其荧光穿透性高于egfp等荧光蛋白,同时由于没有内源活性、其本底信号很低。而gfp等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位,并且其观测不需裂解细胞,方便进行适时观察。
不会干扰,不会影响。
萤火虫荧光素酶在氧气、atp和镁离子同时存在的条件下,催化荧光素氧化,生成氧化荧光素,同时产生黄绿色光,波长540-600nm,一般检测时选用560nm。
海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光,波长460-540nm,一般检测时选用460nm。
不同于绿色荧光蛋白(gfp)需要一定的光激发才能发光,且易淬灭;荧光素酶经过反应本身就可以自发荧光,并且只有在底物存在时才能发光。因此gfp只能用于标记或检测反应是否发生,而荧光素酶报告实验却能通过荧光值定量分析荧光素酶的表达水平。
荧光值过高可能会超出仪器检测范围,从而检测不到值,一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决:
a. 减少质粒转染量;
b. 细胞样品裂解后,离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。
注:不建议通过减少底物量来降低荧光值,需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平,否则会造成检测结果出现大的偏差。
可能原因及凯发k8网页登录的解决方案如下:
(1)实验平行复孔(不同细胞孔):不同孔之间的数值影响因素较多。建议做同一个细胞孔裂解液的技术性平行来检测试剂重复性。
(2)来源于同一个细胞孔的裂解液复孔:注意实验操作、加样顺序、加样速度及加样量。检查排枪加样是否存在不均一问题。
(3)控制不同样品和底物混合后至上机检测的时间间隔尽量一致。
注:荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏,复孔之间的数值有一定差异是正常的,一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。
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