crispr/cas9系统利用sgrna/cas9复合体识别并在dna特异位点造成双链断裂，利用细胞自身修复机制或者与外源dna同源重组实现基因敲、敲入和序列突变。
金开瑞应用crispr/cas9技术，为您提供细胞系基因敲除/敲入/突变等服务，全方位满足您对基因功能研究方面的各项需求。

技术优势

操作简单，靶向精确性更高；
可实现对多个靶基因位点或多个靶基因的同时敲除/敲入/突变；
适用于人、大鼠、小鼠以及部分其他哺乳动物等各种细胞系的靶向敲除/敲入/突变。

服务内容

基因敲除细胞系建立；
基因敲入细胞系建立；
基因定点突变细胞系建立。

服务流程

• 接收订单
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• 基因评估
•  
• sgrna设计
•  
• 表达sgrna和cas9蛋白的慢病毒包装
•  
• 感染细胞
•  
• 细胞药物筛选
•  
• 混合细胞pcr检测
•  
• 细胞分孔，挑取单克隆
•  
• 单克隆扩大培养后pcr测序检测
•  
• 结果交付

客户提供

目的基因序列信息（gen bank accession number、gene id、关键词）；
细胞类型及名称（也可选择由金开瑞代购），细胞培养条件。

最终交付

sgrna序列；
基因敲除/敲入/突变单克隆细胞系；
sgrna-cas9基因敲除/敲入/突变质粒鉴定测序结果；
结题报告（包括实验步骤、测序结果及相关原始图片）。

案例展示

cas9技术敲除细胞系构建案例：

step 1: sgrna设计

step 2: 细胞抗药性筛选预实验

step 3:转染效率测试：明场和绿色荧光

step 4: 药物筛选、单克隆培养及单克隆细胞系靶点检测

利用crispr/cas9技术使动物基因组发生可遗传变异，现已广泛用于基因编辑动物建立。将体外转录的sgrna和cas9 mrna或者体外翻译的cas9蛋白对小鼠/大鼠受精卵单细胞进行胞质或者原核显微注射后，得到基因敲除、敲入或者定点突变的编辑鼠。
金开瑞应用crispr/cas9技术，为您提供大小鼠基因敲除/敲入/突变等服务，全方位满足您对基因功能研究方面的各项需求。

技术优势

专业团队设计基因编辑方案；
配套完整、技术成熟、周期短、成功率高。

应用方向

全身性敲除或条件性敲除大小鼠模型；
敲入性基因编辑大小鼠模型；
    ① 敲入gfp/rfp/lacz等序列，标记内源基因
    ② 与基因组序列替换，引入点突变
成体鼠导入crispr-cas9病毒（腺病毒或者腺相关病毒）进行基因编辑。

服务流程

• 接收订单
•  
• 基因评估
•  
• sgrna-cas9载体构建
•  
• sgrna-cas9细胞活性检测
•  
• 体外转录
•  
• 受精卵显微注射
•  
• f0代基因型鉴定
•  
• f1代基因型鉴定
•  
• 结果交付

服务及交付内容

案例展示

cas9敲除小鼠构建案例：

step 1：根据基因信息，设计sgrna；

step 2：sgrna体外转录；

step 3：受精卵显微注射，假孕鼠回输。鉴定founder小鼠；

step 4: f1杂合子鉴定，交付

模型鼠其他相关业务

国外公司、实验室模型鼠引进业务，包括活鼠引进，精子冻存或者胚胎冻存形式的引进；
小鼠成瘤；
小鼠/大鼠活体成像。

植物转基因技术（transgenic technology），又称遗传转化技术（genetic transformation），是指从动物、植物或微生物中分离到的目的基因或者经过修饰的基因导入植物体内，使目的基因能够在受体内进行稳定的表达和遗传并赋予植物人们所需的性状。
植物遗传转化的应用具有增强植物的耐生物（非生物）逆境、提高作物产量、培育出抗性植株、进行植物修复、生物制药生产等作用，还可以增强农作物的营养成分。

技术流程

模式物种的一般流程：

• pcr/race克隆目的基因
•  
• 构建转化载体（过表达、rnai、crispr/cas9）
•  
• 成熟胚诱导愈伤，制备外植体
•  
• 农杆菌侵染胚性愈伤，诱导出芽
•  
• 抗性t0代植株再生
•  
• pcr检测植株阳性
•  
• qrt-pcr、southern/northern/western blot

非模式物种流程需评估

应用范围

根据物种划分：
    ① 模式植物：拟南芥、烟草；
    ② 经济作物：黄瓜，番茄，大豆，棉花，油菜，苜蓿等；
    ③ 粮食作物：水稻，小麦，玉米，马铃薯等；
    ④ 花卉药材：康乃馨，枸杞等；
    ⑤ 非常规植物或特定品种：香蕉、葡萄等，需要做预实验摸索转化体系。
根据目的划分：
    ① 过表达；
    ② rnai；
    ③ crispr/cas9基因敲除。

客户提供

新鲜或-80℃冻存（视情况而定）的植物组织或幼苗。

最终交付

载体构建测序报告和图片；
外植体侵染、诱导愈伤、胚性愈伤、组织分化、植株再生等图片；
t0代再生植株目标基因pcr检测凝胶电泳图；
包含大致实验步骤、部分可以展示的实验结果的结题报告；
阳性t0代瓶苗或移栽带土苗，或t1代种子。

服务周期

4-7个月，物种和目的不同，周期不同。

应用展示

figure1. phenotypic analysis of 35s::brayab1-702 transgenic arabidopsis thaliana plants.

ck: wild-type arabidopsis thaliana; (a) transgenic plants with mild phenotype;(b) transgenic plants with strong phenotype. 1. seedling stage; 2. rosette stage; 3. flowering and fruiting stage.
（xin-ling zhang, ze-ping yang, jing zhang,et.al. ectopic expression of brayab1-702, a member of yabby gene family in chinese cabbage, causes leaf curling, inhibition of development of shoot apical meristem and flowering stage delaying in arabidopsis thaliana. international journal of molecular sciences, 2013, 14, 14872-14891.）

figure 2. agrobacterium-mediated genetic transformation of four genotypes of nicotiana.

(a) pre culture of explants; (b) co-cultivation; (c) pre-selection;
(d) selection; (e) maturation of cotyledonary stage embryos; (f) elongation and rooting.
（krishna mohan pathi, suresh tula and narendra tuteja. high frequency regeneration via direct somatic embryogenesis and efficient agrobacterium- mediated genetic transformation of tobacco. plant signaling & behavior 8:6, e24354,2013.）

目前微生物基因编辑主要采取传统的crispr/cas9两种技术手段和同源重组（homologous recombination）。
crispr/cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的dna分子之间或分子之内的重新组合。以基因敲除为例，在微生物基因敲除中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体转化到靶微生物后，外源的重组载体与靶微生物中相同的片段会发生同源重组，从而实现靶基因的敲除。

技术流程

同源重组方法进行基因敲除：

• 根据客户提供的信息，设计用于敲除靶基因的序列（上下游1000bp左右）
•  
• 构建用于靶基因敲除的同源重组质粒
•  
• 转化宿主感受态细胞，用抗性标记筛选靶基因敲除菌株，并进行pcr测序验证
•  
• 去除标记，反向筛选无抗性标记的菌株，并进行pcr测序验证
•  
• 挑选1株独立的菌株（菌株权归甲方），验证后交付

应用范围

根据技术划分：
    ① 同源重组方法进行基因组编辑：大肠杆菌、链霉菌（pcr-targeting）、分枝杆菌（耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌、海分枝杆菌、结核分枝杆菌等）、白色念珠菌等；
    ② crispr/cas9：大肠杆菌、沙门氏菌、链霉菌（含模式天蓝色链霉菌和常见的链霉菌）、产溶剂梭菌（及其它常见的梭菌）、枯草芽孢杆菌（需咨询）、酿酒酵母、解脂耶氏酵母（需咨询）、丝状真菌（需咨询）。
根据目的划分：
    ① 过表达；
    ② 定点突变；
    ③ 定点插入外源序列。

客户提供

靶微生物，对于培养条件特殊的物种，还需提供培养所需的试剂。

最终交付

载体构建测序报告和图片；
阳性靶基因敲除株pcr检测凝胶电泳图；
包含大致实验步骤、部分可以展示的实验结果的结题报告；
阳性单克隆突变株。

服务周期

1.5-3个月，物种和目的不同，周期不同。