蛋白质与rna的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mrna组装、病毒复制、细胞发育调控等。蛋白-核酸互作是机制研究的重要组成部分，是表现、功能等研究的进一步深化。今天小编以一篇经典文献带你了解蛋白-核酸互作研究方法。

经典文献解读：myc调控的长链非编码rna（lncrnas）在细胞周期调控和肿瘤发生中的作用

基本信息
题目：role of myc-regulated long noncoding rnas in cell cycle regulation and tumorigenesis
期刊：journal of the national cancer institute (jnci)
影响因子：12.589
主要技术：rna pull-down , lc-ms/ms, chip, rip

研究背景
         哺乳动物基因组编码大量的非编码rna，如micrornas、pirnas和lncrnas。迄今为止，已经注释或鉴定了3万多个lncrnas。目前已经在几种癌症中鉴定到lncrnas，在结直肠癌（crc）中也有一些报道，如ccat1和ccat2，但大部分lncrnas 在crc中的作用仍然鲜为人知，有待阐明。已知转录因子myc调节lncrnas并且与癌细胞增殖和肿瘤发生相关。本文作者利用荧光素酶启动子测定，chip，rna pull-down，缺失图谱测定，lc-ms / ms和rip等方法手段来探索myc调控lncrnas的相关机制。
研究内容及结果
1. 鉴定结直肠癌（crc）中特异表达的lncrnas
         作者利用lncrnas基因芯片来分析正常结肠来源和crc来源的细胞和组织中的lncrnas。结果获得30215个蛋白质编码转录本和33045个有注释或已知的lncrnas。其中在crc中具有表达差异的蛋白质编码转录本（2212/30215）和lncrnas(2325/33045)具有相似的比例，均为7%（图1，a和b）。
在2325个差异表达的lncrnas中，有1265个上调和1060下调（图1c）。作者选取差异倍数大于15倍，p <0.01的差异表达的lncrnas进行race快速扩增, 然后利用qrt-pcr进行验证。结果有4个lncrnas（ccat3、ccat4、ccat5和ccat6）在crc细胞系中上调表达（图1, d-g），ccat7和ccat8在crc细胞系中下调表达（图1，h-i）。利用52个crc组织和它们临近的正常组织（nats）进行验证也证实了上述结果（图j-o）。  
2. 进一步鉴定原癌基因myc调控的crc相关lncrnas
        为进一步鉴定由myc调控的crc相关lncrnas的差异表达，作者利用lncrnas微阵列筛选simyc处理的crc派生细胞系中的lncrnas。结果，在hct116细胞系和rko细胞系中分别鉴定到324、863个由myc调节的lncrnas（图2b,c）。通过进一步筛选获得myc上调的三种lncrnas（ak021907，ac074389.9和ktn1-as1）（图2d）。这些由myc调控的lncrnas 被命名为myclos（myclos-1，myclos-2，myclos-3）。
接下来作者研究了由myc介导调控的myclos在各种癌细胞中是否常见。结果表明，在各种癌症类型的细胞中都能观察到myc介导调控myclos，表明myc介导调控myclos在多种类型的癌症中是保守的（图2e-g）。
        为了进一步验证myc与myclos之间的关系，作者还研究了50个人类原发性结直肠癌组织样本(25个正常结肠和25个crc组织样本)的表达水平，根据myc表达水平分为4个组(图2h)。通过比较四组中myclo-1，-2和-3的表达水平，发现myclo-1，-2和-3的表达水平与myc的表达水平在统计学上显著相关（图2，i-k）。此外，myclos在含有myc过表达的crc细胞系（图1g）中高度表达（图2a）。为测试myc是否在转录水平调节myclo-1，-2和-3，作者利用荧光素酶报道分子对其进行了测定。结果表明，myc基因抑制后，myclos启动子的活性降低，表明myc在转录水平上诱导myclos表达（图2，l-n）。这些结果表明myc诱导的myclos在转录水平上由转录增强子myc直接调节。 3. myc诱导的myclos对cdkn1a、cdkn2b等myc靶基因细胞增殖和表达的影响
       原癌基因myc通过调节许多细胞周期调节基因来促进细胞的增殖。作者将myclo-1，-2或-3以及myc进行敲除，结果细胞增殖减少（图3a，3b）。敲除myclo-1或-2导致细胞在g1期积累，表明myclo-1和-2参与g1 / s转换（图3d）。敲除myclo-3导致s和g2期细胞积累，表明myclo-3在g2期具有调节功能（图3d）。另外作者还鉴定到有190、49和13个细胞周期调节基因分别由myclo-1、myclo-2和myclo-3调控（图3e-f）。  
4. myclos介导的cdkn1a和cdkn2b在远端启动子区域的转录调节
        为阐明myc调控的lncrnas抑制cdkn1a和cdkn2b表达的机制，作者分别在cdkn1a和cdkn2b基因的启动子中扩增了两个不同的区域，一个包括近端myc结合（mb）区域，另一个包括没有mb区域的上游区域。然后利用荧光素酶实验对扩增的区域进行启动子测试（图4a和b）。myc的敲除能诱导无mb区域的上游区域的启动子活性，敲除myclo-1或 -2也能诱导激活cdkn1a 和 cdkn2b的启动子活性（图4a,b）。表明myc不仅在近端区域而且在其启动子的远端区域也可以调控cdkn1a和cdkn2b的转录活性。进一步见鉴定结果表明cdkn1a启动子区域大约在2768bp和2480bp之间对myclo-1调节cdkn1a起关键的作用（图4c），cdkn2b启动子区域大约在840bp和570bp之间对myclo-2调节cdkn2b起关键作用（图4d）。  
5. myclos和rna结合蛋白（如hur和hnrnpk）的相互作用
       为研究myclos的功能机制，作者使用rna pull-down实验及质谱分析的方式鉴定rna-相关的总蛋白（图4e,f）。结果发现10个与myclo-1相关的蛋白和8个与myclo-2相关的蛋白。通过使用rpiseq软件进行预测，作者还发现hur-myclo-1、hnrnpk-myclo-2具有极大相互作用的可能性（图4g，h）。并且通过western blot验证其相互作用（图4e，f）。
 
        为进一步确认hur-myclo-1、hnrnpk-myclo-2之间的相互作用，作者利用rip实验进行了验证。结果与rna pull-down实验结果一致，使用hur抗体的rip样品中myclo-1获得了富集（图4g），使用hnrnpk抗体的rip样品中myclo-2也获得了富集（图4h）。这些结果表明hur与myclo1的交互作用与cdkn1a的转录抑制有关，myclo-2通过与hnrnpk相互作用抑制cdkn2b的转录。
 
6. myclo-2的致癌功能
        作者利用northern blot验证了crc细胞系中myclo-2（ccat6）的过表达。发现大多数crc组织中myclo-2具有非常高的表达水平，在52组相比较的组织样品中有46个crc组织的myclo-2高度表达（图5a）。此外，与正常前列腺来源的细胞相比，myclo-2也在前列腺癌（pc）细胞和组织中过表达（图5b, c）。在体外集落形成测定中，敲除myclo-2能显着减少细胞和集落的数量，表明myclo-2在肿瘤细胞转化中具有作用（图5d）。
另外作者还通过使用myclo-2 sirnas转染肿瘤细胞的体内异种移植，研究了myclo-2在肿瘤发生中的抑制作用。结果表明，myclo-2损耗对肿瘤的发展有明显的抑制作用（图5e）。上述结果表明，myclo-2不仅在肿瘤中过表达，还参与肿瘤发生和肿瘤生长。

文章小结

该文章使用多种技术研究myc调控lncrnas的相关机制，揭示了myclos通过调节已知的myc靶基因的表达来参与细胞增殖和细胞周期的调控，另外还发现myclo-1与hur和myclo-2与hnrnpk之间的相互作用。进一步研究表明这些相互作用可能参与对myc靶标（如cdkn1a和cdkn2b）的调控。此外，将myclo-2进行敲除能够抑制癌细胞转化和肿瘤发生。这些研究成果对于发现新的癌症靶标和研究myc相关的发病机制具有重要意义。

文献来源