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金开瑞客户文献解读：一种由crispr-cas9介导的基因编辑方法
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-02-06 16:45
题目：a generic strategy for crispr-cas9-mediated gene tagging
期刊：nature communications
影响因子：12.124
主要技术：crispr-cas9
一、研究背景
crispr-cas9技术虽然使基因敲除变得简便，但标签插入依然由于每插入一个位点都需要针对该位点构建donor质粒且依赖自发的同源重组而显得昂贵且存在一定难度。本研究发现了一种能解决上述问题的基因标签插入方法，该方法只需构建一个donor质粒即可用于所有位点的精准的标签插入且不依赖于同源重组。
二、研究内容及结果
1. 本研究首先构建了能表达斑马鱼tia1l基因sgrna的donor质粒，该质粒在cas9蛋白的存在下能释放杀稻瘟菌素cds，与携带cas9蛋白和特定位点sgrna的质粒共转入大多数基因都只有1个拷贝的hap1细胞中，初步评估了杀稻瘟菌素cds插入的效率，6个基因12个位点中有11个成功插入了杀稻瘟菌素cds。
图1 不依赖于同源重组的基因标签插入方法
2.对上述筛选到的成功插入杀稻瘟菌素cds的细胞进行克隆分离并检测发现，12个单克隆中有11个是在pam位点前3个碱基处精确插入杀稻瘟菌素cds。
图2 基因标签插入是有效和精准的
3.qpcr检测野生hap1细胞中分别用ifnβ、activin a、fgf1诱导0、4、8、24h后，ifit1、dact1、egr1的表达量均上调。将nanoluc报告基因分别插入ifit1、dact1、egr1，加入诱导剂后 ifit1、dact1、egr1的表达量均上调。nanoglo荧光素酶检测结果与qpcr结果一致，表明本研究中使用的标签插入方法能用来监控内源基因的表达。
图3 细胞系中插入nanoluc报告基因可以监控目标基因表达
4.运用上述的标签插入方法在hap1细胞内源基因lmna、terf1、lamp1中插入荧光标记基因turbogfp并用流式细胞术富集成功插入标签的细胞，以用于活细胞成像研究，可以对目标基因表达产物进行精准定位。
图4 细胞系耐受turbogfp报告基因可以监视亚细胞定位
文章小结
运用本研究中的标签插入方法，可以对目标细胞系靶基因定点插入nanoluc、turbogfp或其他标签，实现对靶基因表达量的监控或进行亚细胞定位。该方法比传统的依赖于同源重组双交换的标签插入方法更加省时，操作上更为便捷，且一个donor载体可以用于不同基因不同细胞的同一种标签插入，节约成本。
参考文献
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