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重组蛋白包涵体究竟是什么？
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-01-05 15:53
包涵体定义
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，很容易形成不可溶、 无生物活性的蛋白聚集体--包涵体。包涵体须经过变性溶解后，在适当条件下复性形成天然的构象，才能得到生物活性蛋白，其生物活性得到恢复。
目前，大肠杆菌表达系统是生产重组蛋白最常用的表达体系，其重组蛋白的表达量可达细胞蛋白的50%，其他成分主要有一些杂蛋白（如 rna聚合酶、核糖体组分、外膜蛋白等）、质粒 dna、rna 片断和脂质、肽聚糖、脂多糖等成分。
然而，重组蛋白的高表达往往导致形成高密度、不溶性蛋白颗粒，即没有生物活性的包涵体，需经过复性后方可恢复蛋白的生物学活性。
包涵体特点
包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、rna聚合酶、外膜蛋白ompc、ompf和ompa等，环状或缺口的质粒dna，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体形成原因
通常情况下认为，包涵体的形成主要有以下几方面原因 ：
（1）宿主的代谢水平会受到重组蛋白高表达的影响，蛋白没有足够的时间进行折叠；
（2）二硫键的形成受到宿主细胞内环境的影响，或者因为二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度；
（3）重组蛋白的氨基酸组成有差异。一般来看，含硫氨基酸和脯氨酸的含量都与包涵体的形成呈明显的正相关；
（4）环境因素，如重组蛋白所处的环境温度、培养基的成分、酸碱度、离子强度等都可影响包涵体的形成，有研究发现，温度与包涵体形成呈正相关，培养基养分不足时，包涵体也容易形成；
（5）重组蛋白在真核生物中翻译后修饰需要相关酶类（如糖基化等），但因其是大肠杆菌的异源蛋白，缺少这种酶类，造成积累大量的中间体，从而形成包涵体沉淀；
（6）细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的化学作用促使包涵体形成。
包涵体变性
在包涵体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的，它们之间的聚集靠非共价键维持，包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等，唯一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。常用5-6mol/l的盐酸胍或 5-8mol/l的尿素。
尿素和盐酸胍对蛋白质的变性作用符合hofmeister规则。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包涵体，使蛋白变性，变性即破坏非共价键，并用还原剂（如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇）打开二硫键。
然而，尿素中的异氰酸盐或酯会引起蛋白质中氨基或巯基的不可逆修饰，而盐酸胍是一种离子型变性剂，它会影响下游的离子交换纯化。但是，盐酸胍的变性能力是尿素的 1.5-2.5倍。
有实验表明，在il-4的变复性过程中，用尿素时蛋白质很难恢复活性，而用盐酸胍来溶解包涵体，可以提高蛋白质的复性率 。
包涵体复性方法
复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，可以获得天然的活性蛋白。应用最普遍的再折叠方法有透析、稀释、超滤等。
（1）将变性蛋白直接稀释于复性液中的复性方法称为稀释复性。这种复性方法最简单、有效。稀释复性很容易操作、放大和操控，所以在生物医药行业和科学研究领域被广泛运用。
稀释复性的蛋白终浓度一般控制0.01mg/ml以下，这是为了防止形成大量的蛋白沉淀和提高可溶性收率。
（2）透析复性是实验室中常用的一种方法，但耗时长，容易形成没有活性的蛋白质聚集体。主要包括一步透析和多步透析两种，最常采用的是多步透析。
透析过程中，通过逐步降低外部复性液中变性剂的浓度，使透析袋内部变性剂的浓度也逐渐降低。与稀释复性相比，这种方法能够在一定程度上提高蛋白质的复性效率。
（3）在高浓度蛋白条件下进行包涵体复性时，常使用外加压力差，加速变性剂去除的超滤复性法。超滤复性是选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过，伴随变性剂除去，以相同的速度加入复性液，蛋白浓度保持不变。
超滤复性具有规模大，耗时少的特点，这种方法较稀释和透析的方法耗时显著减少，因此比较适合工业化生产中应用。
但有些蛋白可能在应用此法复性时，发生不可逆的变性，所以在样品量较少的情况下不推荐使用超滤复性。
包涵体蛋白复性过程
包涵体复性原则
低浓度，平缓梯度，低温。
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