技术专题
免疫印迹实验步骤及问题解决
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-01-21 16:43
一、实验步骤
试剂和缓冲液
1x ripa 缓冲液: 50 mm tris， 150 mm nacl， 0.1% sds， 0.5% sds， 1% triton x-100 或np40.
1x pbs 缓冲液: 137 mm nacl， 2.7 mm kcl， 2.7 mm na2hpo4， 2.7 mm kh2po4， ph 7.4
bca或bradford蛋白分析试剂盒
1.5 m tris缓冲液 （ph 8.8）: 90.68 g tris-hcl to ddh2o， 500 ml溶液ph调节到8.8
1.0 m tris缓冲液 （ph 6.8）: 60.58 g tris-hcl to ddh2o， 500 ml溶液ph调节到6.8
10% aps: 100 mg ap 溶于1 ml ddh2o。 用前准备
10% sds: 10 g sds溶于100 ml ddh2o。
1x tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mm tris， 230 mm 甘氨酸 （ph 8.3）， 0.1% sds。
3x sds蛋白加样缓冲液: 150 mm tris （ph 6.8）， 6% sds， 30% 甘油， 30 mm edta和0.2% 溴酚蓝
1x ttbs: 25 mm tris（ph 7.5）: 0.15 m nacl， 0.05% tween-20， 0.001% 硫柳汞
1x 转移缓冲液: 3 g tris， 14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddh2o 到1l
样品准备
细胞培养样品
贴壁细胞
去除培养基，用1x pbs冲洗去掉残留培养基
加入预冷的400 ul-1 ml 1x ripa缓冲液/100 mm平皿。 在冰上孵育5-10 min。
完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。
（可选）充分混匀或超声处理。
4°c下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清
总蛋白用前需储存在-20°c。
悬浮细胞
（可选）取出100 ul细胞培养也进行细胞计数。
将细胞转移到预冷的1.5 ml或15 ml离心管2000 rpm 4°c离心5 min。
去除培养基并用1 ml预冷的1x pbs重悬细胞，然后转移到1.5 ml离心管中。
2000 rpm 4°c离心5 min。
用1 ml预冷的ripa 缓冲液/107细胞重悬细胞
细胞悬液在冰上孵育并摇床30 min，或充分混匀或超声处理。
4°c 12000 rpm离心10-15 min收集上清备用。
总蛋白需要在用前储存在-20°c 。
组织
组织准备和定量。将组织切成小块。
加入500-600 ul预冷的1x ripa缓冲液/100 mg 组织。
将组织充分混匀
4°c 12000 rpm离心15-20min。
收集上清。
总蛋白在用前应储存在-20°c。
蛋白定量
bradford分析和bca分析请查看来邦的综述 蛋白定量。
sds-page
聚丙烯酰胺凝胶
6%-15% 分离胶上注入5%的浓缩胶并插上梳子（10或者15孔）。
| 分离胶浓度（%） | 蛋白大小范围（kda） |
| 8 | 25-200 |
| 10 | 15-100 |
| 12.5 | 10-70 |
| 15 | 12-45 |
| 20 | 4-40 |
表1： 蛋白分离范围由分离胶浓度决定。
上样和电泳
2x sds蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。
注胶前先将样品在50-60°c预热。预染marker可用于监控蛋白分离和转移效率。
在1x tris-甘氨酸缓冲液在60-120v跑电泳1-3小时
| 分离胶（10ml） | 浓缩胶（3ml） | |||||
| 6% | 8% | 10% | 12% | 15% | 6% | |
| h20 | 5.3 | 4.6 | 4.0 | 3.3 | 2.3 | 2.1 |
| 30% 丙烯酰胺混合物* | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 | 0.5 |
| 1.5m tris（ph 8.8） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 1.0m tris （ph 6.8） 0.38 |
| 10% sds | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.03 |
| 10% aps | 0.1 | 0.1 | 0.1 | .1 | 0.1 | 0.03 |
| temed | 0.008 | 0.006 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.003 |
表2：分离胶（10ml）和浓缩胶（3ml）的制备方案
蛋白转移
将蛋白转移到pvdf或nc*膜上进行抗体检测
1.将电泳材料，如胶、whatman纸和海绵放入1x转移缓冲液中预先浸润.
2.pvdf膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中
3.将材料按如下顺序放置:板（黑色面）， 海绵， whatman纸， 胶， 膜， whatman纸， 海绵， 板（亮面）.
4.将转移装置安置好，黑色面对应黑色电极。
5.转移到冷的1x转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。
* nc膜不能用甲醇孵育。
将膜放入溶有5%脱脂奶粉的1x tbst中25°c孵育1小时 （或在摇床上4°c孵育过夜）。
抗体孵育
1.按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1x tbst+3% bsa中。
2.在4°c孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。
3.回收一抗，保存在4°c。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10 min。
4.将二抗放入1x tbst中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°c摇床上2-4小时。
5.在室温摇床上用tbst洗三次，每次10 min
ecl+ 系统和x-ray胶卷被用于hrp标记的二抗。
二、问题解决
没有信号，可能原因
检测的二抗用错了（明确一抗制备的宿主）
一抗或二抗的浓度太低（提高浓度再试一次）
一抗不能识别检测物种的蛋白（检查一抗的特异性）
上样蛋白量太少（增加样品的量）
转移效率太低（改进转移实验步骤。确保pvdf膜用之前用甲醇预孵育）
一抗已经被用很多次了（使用重新稀释的一抗）
封闭时间太长或者洗涤次数太多（减少封闭时间和洗涤次数）
检测试剂盒失效（加入阳性对照并确保试剂盒有效）
叠氮化钠可能抑制二抗（溶解缓冲液中应避免使用叠氮化钠）
一抗或二抗的孵育时间太短（延长孵育时间）
背景太亮
封闭时间太短或者封闭缓冲液有问题（延长封闭时间或者用bsa代替脱脂奶粉）。
一抗或二抗浓度太高。（降低抗体浓度）
洗脱不充分（增加洗脱次数）
孵育温度太高 （确保一抗在4°c孵育）
膜使用错误或者膜已经干了 （避免膜变干）
白色条带或者信号消失很快
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
条带弯曲
电泳电压太高，或者电泳过程中缓冲液温度太高。（降低电压，电泳缓冲液置于冷的环境中）
条带弥散
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
上样蛋白量太大 （降低上样量）
空白区域
转移不均衡（确保膜均衡的贴到胶上，没有气泡）
非特异性信号
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
条带脏或者模糊
平衡时间不够，或者胶与膜的接触不均衡。（确保胶没问题，改进转移步骤）
秃斑
胶与膜之间有气泡（确保胶与膜之间没有气泡）
条带大小与理论不符
一抗特异性差（更换一抗）
一些蛋白可能移动与理论大小差别较大。
不能阐释可能的翻译后修饰
翻译后修饰例如多聚（adp-核糖基）-par链（它能够介导蛋白分子带负电荷）不能通过sds-page分别。 不过它们能通过ctab-page分开。 ctab， 溴化十六烷基三甲基铵 （(c16h33）n(ch3)3br， cetyltrimethylammonium bromide， hexadecyltrimethylammonium bromide）是一种基于氨阳离子的表面活性剂。
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