技术专题
rna fish揭示植物细胞中单个rna转录物的变化
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-03-28 14:58
题目：mutually exclusive sense-antisense transcription at flc facilitates environmentally induced gene repression
期刊：nature communications
影响因子：12.353
主要技术：rna fish
研究背景
在探究非编码rna的调控机制中，有相当多的研究者对反义转录感兴趣，反义rna可通过碱基配对与mrna互补并最终抑制mrna翻译。例如，反义rna在环境胁迫下调控拟南芥的春化过程，其中开花基因位点flowering locus c（flc）在寒冷诱导后出现表观遗传沉默。春化早期阶段的一组反义转录物（coolair）包含着flc基因座位点，但两者的关联机制尚不清楚。在持续的寒冷暴露下，选择透明度高的拟南芥根部结构作为理想组织，采用单细胞rna fish方法来可视化和定量植物细胞中单个rna转录物的变化。
研究内容及结果
1. 单细胞rna fish用于细胞分析
作者采用单细胞rna fish来可视化和定量植物细胞中的单个rna转录物水平，选取透明的发育良好的拟南芥根部做实验组织。随着寒冷暴露时间的延长，flc信使rna（mrna）转录物在每个细胞中显示出逐级减少（图1a-1c）。在六周的寒冷暴露后组成性基因蛋白磷酸酶2a（pp2a）的表达水平依然很高，这与flc-mrna的rt-rcr测量结果一致。与此同时，在两周的寒冷暴露后，flc非剪接转录迅速减少且许多细胞显示没有荧光信号（图1a，1b和1d）。对比寒冷暴露前后，实验结果中没有明显地发现mrna重新定位和mrna信号分布的变化。由此看出，在寒冷的环境中，拟南芥根部迅速在基因座上关闭flc转录的动态变化。
期刊：nature communications
影响因子：12.353
主要技术：rna fish
研究背景
在探究非编码rna的调控机制中，有相当多的研究者对反义转录感兴趣，反义rna可通过碱基配对与mrna互补并最终抑制mrna翻译。例如，反义rna在环境胁迫下调控拟南芥的春化过程，其中开花基因位点flowering locus c（flc）在寒冷诱导后出现表观遗传沉默。春化早期阶段的一组反义转录物（coolair）包含着flc基因座位点，但两者的关联机制尚不清楚。在持续的寒冷暴露下，选择透明度高的拟南芥根部结构作为理想组织，采用单细胞rna fish方法来可视化和定量植物细胞中单个rna转录物的变化。
研究内容及结果
1. 单细胞rna fish用于细胞分析
作者采用单细胞rna fish来可视化和定量植物细胞中的单个rna转录物水平，选取透明的发育良好的拟南芥根部做实验组织。随着寒冷暴露时间的延长，flc信使rna（mrna）转录物在每个细胞中显示出逐级减少（图1a-1c）。在六周的寒冷暴露后组成性基因蛋白磷酸酶2a（pp2a）的表达水平依然很高，这与flc-mrna的rt-rcr测量结果一致。与此同时，在两周的寒冷暴露后，flc非剪接转录迅速减少且许多细胞显示没有荧光信号（图1a，1b和1d）。对比寒冷暴露前后，实验结果中没有明显地发现mrna重新定位和mrna信号分布的变化。由此看出，在寒冷的环境中，拟南芥根部迅速在基因座上关闭flc转录的动态变化。
图1 单细胞定量春化过程中mrna表达和flc转录水平
2. 寒冷暴露后coolair聚集在flc附近
在温暖生长条件下，仅约有30%的植物细胞检测到非剪接转录物的内含子探针（图2a-2b），揭示了在寒冷暴露初期低表达水平的coolair被激活。经过两周的寒冷暴露后，在超过约30%根部总细胞数的各类型细胞中，均检测到大量的non-spliced coolair和coolair（图2b-2c）。在寒冷暴露的根细胞中进行连续rna-dna fish检测，范围大的coolair荧光焦点中心与flc dna fish荧光信号共定位（图2d），单细胞rna fish和补充实验也同样说明了coolair像“云”一样聚集在flc出现的场所（图2e）。正如图2f所示，作者在coolair最大内含子区域的5’或3’末端设计特定探针，在两周的寒冷暴露后，在一些细胞核心区域中5’端探针组发出更高的信号，而在另一些细胞核中5’端探针组和3’端探针组均显示出同等类似的强信号（图2g-2h），由此推测“云”结构可能是由基因座转录的逐渐累积形成的。
在温暖生长条件下，仅约有30%的植物细胞检测到非剪接转录物的内含子探针（图2a-2b），揭示了在寒冷暴露初期低表达水平的coolair被激活。经过两周的寒冷暴露后，在超过约30%根部总细胞数的各类型细胞中，均检测到大量的non-spliced coolair和coolair（图2b-2c）。在寒冷暴露的根细胞中进行连续rna-dna fish检测，范围大的coolair荧光焦点中心与flc dna fish荧光信号共定位（图2d），单细胞rna fish和补充实验也同样说明了coolair像“云”一样聚集在flc出现的场所（图2e）。正如图2f所示，作者在coolair最大内含子区域的5’或3’末端设计特定探针，在两周的寒冷暴露后，在一些细胞核心区域中5’端探针组发出更高的信号，而在另一些细胞核中5’端探针组和3’端探针组均显示出同等类似的强信号（图2g-2h），由此推测“云”结构可能是由基因座转录的逐渐累积形成的。
图2 寒冷暴露后在一些细胞中coolair转录迅速增加并覆盖位点
3. coolair转录和flc转录在基因座水平上呈现反相关
在寒冷暴露下，作者通过单分子rna fish显像技术分析“云”结构对flc转录的影响机制。正如图3a所示，在植物正常暴露或寒冷暴露下，coolair转录（绿色）和flc（红色）转录显示相互排斥的关系，在单个基因座上正义转录和反义转录也呈现反相关，结果表明基因座上的转录在任何给定时间下都是单向的（图3b）。尽管flc正义转录和反义转录可能在单个细胞中共存，但也总是在给定时间内从不同等位基因上转录而来（图3c）。另外有报道指出，coolair停留在flc转录位点并以顺式方式调节flc转录，佐证了寒冷暴露下大多数基因座诱导coolair转录和关闭flc转录。
在寒冷暴露下，作者通过单分子rna fish显像技术分析“云”结构对flc转录的影响机制。正如图3a所示，在植物正常暴露或寒冷暴露下，coolair转录（绿色）和flc（红色）转录显示相互排斥的关系，在单个基因座上正义转录和反义转录也呈现反相关，结果表明基因座上的转录在任何给定时间下都是单向的（图3b）。尽管flc正义转录和反义转录可能在单个细胞中共存，但也总是在给定时间内从不同等位基因上转录而来（图3c）。另外有报道指出，coolair停留在flc转录位点并以顺式方式调节flc转录，佐证了寒冷暴露下大多数基因座诱导coolair转录和关闭flc转录。
图3 coolair转录和flc转录在基因座水平上呈现反相关
4. coolair促进关闭flc转录表达
为验证上述的结论，作者采用血管前体细胞开展coolair表达验证实验，并探究flc抑制程度是否取决于coolair的存在（图4a）。经过两周的寒冷暴露后，根组织中flc转录在约20%无coolair表达细胞中（图4c）和约75%coolair表达细胞中（图4b）下调。与此同时，作者分析得知寒冷诱导后coolair引起在flc-tex缺陷表达的线性区域上flc转录下调（图4d），flc正义转录在flc-tex缺陷表达的线性区域上较小幅度的下调（图4d）。重要的是，这种拮抗效应只在coolair表达细胞中发现，而在非coolair表达细胞中没有观察到flc抑制。以上数据说明，植物在寒冷暴露时coolair的累积加速了flc抑制效应。
为验证上述的结论，作者采用血管前体细胞开展coolair表达验证实验，并探究flc抑制程度是否取决于coolair的存在（图4a）。经过两周的寒冷暴露后，根组织中flc转录在约20%无coolair表达细胞中（图4c）和约75%coolair表达细胞中（图4b）下调。与此同时，作者分析得知寒冷诱导后coolair引起在flc-tex缺陷表达的线性区域上flc转录下调（图4d），flc正义转录在flc-tex缺陷表达的线性区域上较小幅度的下调（图4d）。重要的是，这种拮抗效应只在coolair表达细胞中发现，而在非coolair表达细胞中没有观察到flc抑制。以上数据说明，植物在寒冷暴露时coolair的累积加速了flc抑制效应。
图4 coolair促进关闭flc转录表达
文章小结
本文旨在探讨在寒冷暴露下拟南芥中反义转录物（coolair）和开花基因座c（flc）在表观遗传沉默中的相互作用，flc作为一种向生殖过渡的调节因子。本文作者采用单分子rna fish来处理和跟踪细胞水平上coolair和flc的转录关系，发现正义转录和反义转录物虽然在同一细胞中可同时出现但在单个基因座上相互排斥。寒冷条件强烈地刺激大多数细胞中 coolair转录上调，并且通过相互排斥的关系促进了顺式细胞中的flc转录关闭。coolair转录后在每个位点形成密集的云结构，并通过改变h3k36me3动力学作用影响flc转录。综上所述，反义转录的拮抗效应可能是许多表观遗传进化的核心机制，本文研究对丰富反义转录和植物表观遗传相关联的的调控机制具有深远的意义。
解析文献
rosa s., duncan s., dean c. mutually exclusive sense-antisense transcription at flc facilitates environmentally induced gene repression[j]. nature communications, 2016, 7: 13031.
本文旨在探讨在寒冷暴露下拟南芥中反义转录物（coolair）和开花基因座c（flc）在表观遗传沉默中的相互作用，flc作为一种向生殖过渡的调节因子。本文作者采用单分子rna fish来处理和跟踪细胞水平上coolair和flc的转录关系，发现正义转录和反义转录物虽然在同一细胞中可同时出现但在单个基因座上相互排斥。寒冷条件强烈地刺激大多数细胞中 coolair转录上调，并且通过相互排斥的关系促进了顺式细胞中的flc转录关闭。coolair转录后在每个位点形成密集的云结构，并通过改变h3k36me3动力学作用影响flc转录。综上所述，反义转录的拮抗效应可能是许多表观遗传进化的核心机制，本文研究对丰富反义转录和植物表观遗传相关联的的调控机制具有深远的意义。
解析文献
rosa s., duncan s., dean c. mutually exclusive sense-antisense transcription at flc facilitates environmentally induced gene repression[j]. nature communications, 2016, 7: 13031.