技术专题
a metabolite-derived protein modification integrates glycolysis with keap1-nrf2 signaling 多组学联合揭示糖酵解和keap1-nrf2信号转导的整合机制
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-06-10 09:53
期刊：nature
if：41.577
技术：定量蛋白质组、靶向代谢组、prm
研究背景：
细胞代谢和信号调节整合对于维持细胞稳态是极其必需的。细胞内生、固有活性代谢物能够调节蛋白质功能，进而影响细胞的生命活动。keap1是一种重要的“亲电性传感器”蛋白，可对内源性和外源性分子做出反应，其共价修饰会导致 nrf2 的累积，从而启动细胞保护基因转录。因此，作者希望能揭示糖酵解和nrf2信号传导之间的直接联系。
研究结果：
1.imr32细胞表型筛选，确定激活 nrf2信号传导的化合物
为了发现keap1-nrf2信号传导途径的非共价调节因子，以及其潜在调节的新作用机制，作者使用nrf2依赖性荧光素酶报告基因（pti-are-luc）进行了基于imr32细胞的高通量表型筛选。从多种杂环化合物库中，作者鉴定到一种cbr-470-0化合物，其系列化合物（如cbr-470-1）处理imr32细胞后可导致nrf2蛋白的积累呈现时间依赖效应（图1b）。根据imr32细胞（cbr-470-1处理24h后）表达谱显示，最显著富集的基因组是由nrf2靶基因组成的“nfe2l2 targets” （图1c-1d），这表明cbr-470-系列化合物可以在体外诱导nrf2信号通路激活。
接下来，作者进一步确定cbr-470-系列化合物参与体内的诱导过程。balb/c小鼠口服cbr-470-2化合物，通过qrt-pcr检测在几个器官中nrf2靶基因的表达情况，发现在皮肤中观察到nqo1和hmox1的转物水平呈现剂量依赖性增加（图1e）。已有研究表明nrf2可以有效防止紫外线照射导致的光老化表型和皮肤癌变，进而作者在急性uv损伤小鼠模型中评估cbr-470-2的活性，发现cbr-470-2可以减少紫外线照射后的小鼠模型表皮厚度，与nrf2细胞保护程序的激活一致（图1g-1h）；由此表明cbr-470-系列化合物可以在体内诱导nrf2信号通路激活。
图1 cbr-470-系列化合物在体外和体内均激活nrf2信号传导
2.cbr-470-1激活nrf2信号传导的机制
为了确定cbr-470-1激活nrf2信号传导的机制，作者合成了含有生物素和二氮杂萘取代基的荧光亲和探针（称为cbr-470-pap），并使用5μm剂量去处理imr32细胞1小时，在紫外线照射后进行细胞裂解液的抗生物素蛋白质印迹分析（图2a）；再接着通过生化分离和lc-ms/ms分析磷酸甘油酸激酶1（pgk1）是否作为cbr-470-pap的潜在靶标（图2b-2c）。体外重组蛋白的结合实验表明cbr-470-pap选择性标记了pgk1；而imr32细胞中pgk1蛋白的敲低和过表达实验发现，cbr-470-1处理组的 ec50值分别表现出降低和增加（图2d-2e），且烯醇酶1（pgk1下游的酶）消耗加快；靶向代谢物组学分析发现，cbr-470-1处理的imr32细胞中pgk1 上游代谢物水平快速增加以及下游代谢物快速消耗；上述结果表明，糖酵解中间体可参与nrf2信号传导，cbr-470-1可通过调节pgk1活性来影响糖酵解途径和nrf2活化过程。
图2 糖酵解依赖 cbr-470-1 激活 nrf2 信号传导
3.mgx介导了糖酵解和keap1-nrf2信号通路的直接联系
作者先研究由pgk1直接代谢的1,3-bpg是否可能通过由keap1的磷酸甘油基-赖氨酸（pgk）修饰来参与keap1-nrf2途径的信号传导。在cbr-470-1处理imr32细胞30分钟后，1,3-bpg水平升高，keap1水平没有明显改变；但是wb结果显示cbr-470-1发生作用依赖于高分子量 keap1（hmm-keap1）的形成，其分子量大约是单体 keap1 的两倍（图3a）。除1,3-bpg外，其他糖酵解的中心代谢产物，如磷酸丙糖异构体d-甘油醛-3-磷酸（gap）和磷酸二羟丙酮（dhap），以及它们的非酶解产物甲基乙二醛（mgx），这些亲电羰基化合物都可以作为反应官能团修饰蛋白残基。在这些候选物中，仅有mgx处理的细胞裂解物或活细胞可导致hmw-keap1的选择性形成（图3b-3c），并功能性地激活下游nrf2靶基因nqo1和hmox1的表达（图3d）；同时衍生化mgx的靶向lc-ms检测也证实cbr-470-1处理细胞的最初几小时内mgx水平显著地升高（图3e）。因此上述结果说明糖酵解和由mgx直接修饰keap1介导的keap1-nrf2信号通路之间存在直接联系。
图3 mgx修饰keap1形成共价的高分子量二聚体并激活nrf2信号传导
4.silac 定量蛋白质组学和prm靶向蛋白质组学确定了影响 hmm-keap1 形成的关键结构域
接下来，作者进一步选用silac 定量蛋白质组学方法确定hmw的结构域和残基（图4a），结果表明ntr（n-末端区域，氨基酸1-50）和btb结构域（氨基酸150-169）作为可能参与hmw的候选结构域和残基，它们响应了cbr-470-1诱导的hmw-keap1二聚体形成过程（图4b-4d）。同时，作者检测了这些结构域内的十多个c-to-s，k-to-m/r和r-to-a突变，以及keap1中其他已知的功能残基对hmw-keap1形成的影响；结果发现两个精氨酸残基突变（ntr结构域的r15和btb结构域的r135）显著但不完全地减少了hmw-keap1的形成，而btb结构域中c151s突变对hmw-keap1形成的几乎完全抑制（图5a）。由此，作者通过合成一个含有半胱氨酸和精氨酸的模型肽，来确定mgx可能介导上述残基之间的修饰；采用甘氨酸接头分开模型肽，并在生理温度和ph下用mgx处理过夜，可发现形成翻译后修饰出新的甲基咪唑（mica）。
随后，作者在纯化mica后通过一系列一维和二维nmr实验证实了其结构（图5d）；并采用cbr-470-1或mgx处理细胞，经过凝胶分离hmw-keap1和单体keap1后进行lc-ms/ms分析，来确定是否在keap1蛋白内发生mica修饰（图5c-5d）。在来自cbr-470-1和mgx处理的分离的hmw-keap1中鉴定了在c151和r135之间具有mica交联肽，但在分离的单体keap1中未鉴定到（图5e）。此外，prm的并行反应监测也证实了hmw-keap1中独特存在的十几个母-子离子跃迁的存在和共洗脱的存在（图5f；图6a-6b）。综上所述，作者发现糖酵解代谢过程是通过反应性糖酵解代谢物mgx与前哨蛋白keap1的直接相互作用来偶联nrf2依赖性基因的表达，并形成稳定且新型的翻译后修饰蛋白质来介导糖酵解途径（图5g）。
图4 基于silac的keap1修饰蛋白质组学表征hmm-keap1结构域
图5 甲基乙二醛在keap1中的近端半胱氨酸和精氨酸残基之间形成新的翻译后修饰
图6 prm分析mica交联肽
研究结论：
作者确定了糖酵解酶pgk1的小分子抑制剂，并揭示了糖酵解和nrf2信号传导之间的直接联系。pgk1的抑制导致活性代谢物mgx的积累，其选择性地修饰keap1以便在近端半胱氨酸和精氨酸残基（mica）之间形成甲基咪唑交联；该翻译后修饰的过程导致keap1的二聚化、nrf2的积累和nrf2转录程序的激活。总的来说，在糖酵解和keap1-nrf2信号传导之间存在着直接的通信联系，由此更加深入地了解细胞应激反应后的代谢调控机制。
金开瑞推荐技术服务：
新技术的不断涌现，加快了多组学研究向定量化、高通量的发展，在分子水平研究基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，已成为人们发现生命化学物质基础和深入了解其分子机制的新方向。
多组学数据整合分析，有利于系统性地研究临床发病机理、确认疾病靶点，发现生物标志物与进行疾病早期诊断，从而对个体化治疗和用药指导发挥重要作用。
金开瑞现提供下述多组学技术服务，并赠送对应关联分析：
| 多组学项目 | 赠送关联分析类型 |
| 转录组+蛋白质组 |
转录组+蛋白质组定性分析
转录组+蛋白质组定量关联分析
转录组+蛋白质组层次聚类分析
转录组+蛋白质组go、pathway富集分析 |
| 蛋白质组+代谢组 |
蛋白质组+代谢组 pca 比较分析
差异蛋白+差异代谢物表达量相关性分析
差异蛋白+差异代谢物pathway分析
蛋白质组+代谢组相关性分析（矩阵热图和相关性网络）
加权基因共表达网络分析（wgcna，≥15 sample）
|
| 转录组+蛋白质组+代谢组 |
表达量相关性分析
差异表达分析
pathway富集分析
|
活动进行中~ label-free修饰引物