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q:rna pull down的实验原理是什么?为什么要做rna pull down?

rna pull down使用体外转录法标记生物素rna探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成rna-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过western blot实验检测特定的rna结合蛋白是否与rna相互作用。 蛋白质与rna的相互作用是许多细胞功能的核心,如蛋白质合成、mrna组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确,选择western blot鉴定;若不明确,则可选择质谱鉴定。

q:rna pull down实验前富集lncrna都有哪些方法?

lncrna的富集大致上有三种方法: (1)探针法:针对该lncrna的序列,设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性,所以最好用northern blot检测探针的特异性。 可以结合内源的lncrna是探针法的最大优势。缺点就是比较贵,需要的样品量大。 (2)生物素标记法:在lncrna的5‘端加上t7启动子,利用体外转录试剂盒,可以制备大量的lncrna。再通过生物素标记试剂盒,就能得到大量的生物素标记的lncrna。常用的折叠的方法退火,从95℃退火到4℃,大约30秒一度就可以了。 (3)trsa法:除了生物素,链霉亲和素还可以识别trsa结构,因此在lncrna的一端加上trsa序列也是不错的选择。

q:rna pull-down是否可以做circrna?

可以,前提是circrna在细胞中表达丰度要高。

q:rna pull down的实验有对照吗?

有,探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列:探针的反义序列以及长非编码rna的反义序列。trsa法的对照是trsa序列本身。

q:rna pull down的实验如何防止rna降解?

rna pull down实验的一大难点就是rna本身易降解,所以过程中要禁止rnase,以防止降解。因此在整个实验过程中除了ep管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌,所有试剂均需要depc·h2o配置并灭菌!处理后的耗材需要尽快用掉,超过两周则需要重新处理。操作台需要用rnasezap擦净,以去除环境中的rna酶的影响。

q:rna pull down后银染,条带背景深是什么原因?

背景深需考虑是不是sds-page染色时间过长或者抗体的质量问题,多克隆抗体经常会出现这种情况,最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了,针对这一点,有以下解决措施: (1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件; (2)优化缓冲体系,使用严谨性高的缓冲体系; (3)提高裂解液的质量。

q:rna pull-down拉下蛋白page电泳银染条带颜色浅且模糊是什么原因?

可能的原因有以下几点: (1)选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低; (2)体外转录得到的rna降解或者不是全长; (3)pull-down实验孵育时间不长。

q:rna pull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白是什么原因?

可能的原因有以下几点: (1)选取的rna序列不对; (2)样品中没有表达互作的蛋白质。 (3)互作蛋白浓度低,银染图肉眼观察不到差异条带。

q:rna pull-down质谱样品数量到底有多少个?

质谱样品数量根据相应结果而定,合同中初定是2个样品,根据实际质谱数量多退少补。样品数量可以是1个,也可以是多个(含3个),不要轻易去承诺客户,一切以合同内容为准。

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