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酵母双杂交技术的优势及关键点
文章来源:原创 作者:genecreate 发布时间:2017-12-22 14:58
        分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展,为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势,已出现了很多新技术,酵母双杂交就是其中的一种。酵母双杂交可以简要概括为:基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近,诱导了基因的表达。
 
蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用,具有其独特优势。
1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行,蛋白质保持天然的折叠状态,蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。
2、双杂交系统的敏感度非常高,蛋白质之间结合常数低至1mmol/l时都可以被侦测。
3、在筛选文库时,双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列,省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。
 
经典的酵母双杂交技术的建立的主要关键点在于酵母双杂系统的转录因子和报道株。
 
一、转录因子
        典型的转录因子含有dna结合区 (dna-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。dna结合区带共性的结构主要有:1)hth 和 hlh 结构:由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成,α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接,即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2)锌指结构: 多见于 tfiii a 和类固醇激素受体中,由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 zn2+ ,其余约 12-13个残基则呈指样突出,刚好能嵌入 dna 双螺旋的大沟中而与之相结合。3)亮氨酸拉链结构:多见于真核生物 dna 结合蛋白的 c 端,与癌基因表达调控有关。由两段α - 螺旋平行排列构成,其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基,亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状,两条肽链呈钳状与 dna 相结合。
 
1、酵母双杂系统的转录因子
        酵母双杂交技术的建立要归功于fields对酵母转录因子gal4的研究,gal4包括两个彼此分离的结构域.。位于n端1-147位氨基酸残基区段的dna结合域(dna binding domain,dna-bd)和位于c端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(activation domain,ad)。dna-bd能够识别位于gal4效应基因(gal4-responsivegene)的上游激活序列(upstream activating sequence,uas),并与之结合。而ad则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动uas下游的基因进行转    录。dna-bd和ad单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的gal4转录因子活性并可激活uas下游启动子,使启动子下游基因得到转录。
2、筛选方法
        酵母双杂采用营养缺陷型的筛选方法。双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有dna结合结构域(dna binding domain,简称为bd)和转录激活结构域(activation domain,简称为ad),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别dna上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自的功能。酵母双杂交系统利用杂交基因激活报道基因的表达,探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的bd虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的bd和ad形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的gal4蛋白的bd与大肠杆菌的一个酸性激活结构域b42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到gal4结合位点并激活转录。
 
二、报道株
       双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:1)易于转化、便于回收扩增质粒。2)具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3)酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacz), 从而可分析蛋白间的结合作用。
 
       说了这么多,其实酵母双杂交并不止这一种模式,经过科学家的不断努力和创新,现在常用的酵母双杂交系统还有基于分离的泛素的膜蛋白酵母双杂交及基于ras信号通路的酵母双杂系统。
 
        基于分离的泛素的膜蛋白酵母双杂交系统的基本思路和上文介绍的经典系统基本一致,只是将互作的场所搬到了细胞膜上,由于涉及到膜蛋白的方向性,在载体选择和实验设计上较经典模式更复杂。
 
        基于ras信号通路的酵母双杂系统使用的是酵母细胞的温度敏感型菌株,利用的是蛋白的互作激活ras信号通路才能使酵母细胞在低温下存活的思路。
 
        酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。③杂交蛋白稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子dna结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mrna产生多种稳定的酶使信号放大。同时, 酵母表型、x-gal及his3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交技术以其简便,灵敏,高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点,在蛋白互作的研究中将得到更为广泛的应用。
 
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