技术专题
ta克隆原理及方法
文章来源：原创
作者：genecreate
发布时间：2017-12-27 16:39
一、pcr产物的t载体克隆
（一）重组t质粒的构建
一．原理
外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有一种大肠杆菌dna连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。t4噬菌体dna 连接酶催化dna 连接反应分为3 步：首先，t4 dna 连接酶与辅因子atp形成酶-atp复合物；然后，酶-atp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，使dna腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为dna片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接dna片断的3’oh末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。taq dna酶扩增的pcr产物，其dna双链前后末端都有一个游离的a碱基，可以与pgem-t easy vector 末端游离的t碱基互补形成环状重组t质粒。
二．材料与方法
1 材料
外源dna片断
2 仪器、用具
移液枪、碎冰
3 试剂
pmd 18-t vector；ligation buffer；t4 ligatease；ratp
4 方法
连接体系如下：
16℃连接过夜。
（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定
1 材料
e.coli jm109菌株
2 仪器、用具
超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器
3 试剂
(1) cacl2、lb平板（见附录）；soc培养基（见附录）；sob培养基
(2) rnase a1；buffer s1；buffer s2；buffer s3；buffer w1；无水乙醇的buffer w2a
(3) 1×电泳缓冲液（tae）；溴化乙锭溶液（eb）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液
(4) 酚；氯仿；异戊醇
(5) ddh2o；10×pcr buffer (mg2+ plus)；dntp；m13+；m13-；takara rtaq酶
4 方法
1. 大肠杆菌感受态细胞的制备
(1) 取大肠杆菌jm109保存液50μl，接种于4ml lb（或sob）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl 转接到新的4ml lb（或sob）液体培养基中扩大培养3h至od600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。
(2) 4℃，5000rpm离心2min，去上清液。
(3) 加入750μl预冷的0.1m cacl2重悬菌体，冰浴30min。
(4) 4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。
(5) 加入100μl 冰冷的0.1m cacl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。
2. 重组dna的转化
(1) 将含amp、x-gal、iptg的lb平板37℃预热。
(2) 于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。
(3) 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。
(4) 在离心管中加入soc培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。
(5) 将200μl 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml amp、20mg/ml x-gal、200mg/ml iptg 的lb平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
注意事项：
① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。
② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。
③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
3． 重组质粒的鉴定
方案一 菌落pcr
(1) 制备pcr混合液：
(2) 用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中
(3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。
(4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入takara rtaq酶0.25ul。
(5) 按以下条件进行pcr反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条
件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(6) 取5μl pcr产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二 质粒pcr
1. 碱裂解法少量制备质粒dna
(1) 用离心管收集4ml在lb培养基（含amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。
(2) 用250μl已加入rnase a1的buffer s1充分悬浮细菌沉淀。
(3) 加入250μl buffer s2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。
*buffer s2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的co2中和buffer s2中的naoh，降低溶菌效率。
(4) 加入400μl buffer s3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。
(5) 将dna-prep tube置于2-ml microfuge tube中，将步⑷中的混合液移入dna-prep tube中，5500rpm离心1min。
(6) 弃滤液，将dna-prep tube置回到原2-ml microfuge tube中，加入500μl buffer w1，5500rpm离心1min。
(7) 弃滤液，将dna-prep tube置回到原2-ml microfuge tube中，加入700μl已加无水乙醇的buffer w2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的buffer
w2洗涤一次。
(8) 弃滤液，将dna-prep tube置回到原2-ml microfuge tube中，14000rpm离心1min。
(9) 连滤液一并弃掉收集管，将dna-prep tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜
中央加入25-30μl eluent或去离子水。
(10) 室温静置2 min，14000rpm离心1min洗脱dna。
(11) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
2. 抽提纯化质粒dna酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒dna中残留的蛋白质。
(1) 加te稀释质粒dna溶液至300μl。
(2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3min。
(3) 14000rpm 离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3min。
(4) 14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3min。
(5) 14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，沉淀质粒dna。
(6) 14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200μl 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μl去离子双蒸水溶解质粒dna沉淀，-20℃保存待用。
(7) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
3. 质粒pcr
(1) pcr反应体系如下：
(2) pcr 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：
94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(3) 取5μl pcr产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
二、pcr产物的克隆
pcr产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的pcr产物直接进行连接。载体可用ecor v或sma i切成平头；pcr产物纯化后，可以在22℃用dna聚合酶i作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，pcr产物也可不加处理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的pcr产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入peg 8000，也只能很有限地提高效率。
粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和pcr产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分pcr产物3’端带有一个凸出的damp的特性，构建3’端带有凸出的dtmp的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dntp、即dttp的反应体系中用taq dna聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加t反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加t反应。载体自连、pcr产物串连可以忽略。如果使用ddttp，效果会更好。这种方法一般称为加t/a法克隆，比平头连接效率高50～100倍。
（一）、pcr产物的ta克隆
1. ta克隆构建原理：ta克隆系统由invitrogen公司（san diego，ca）发展而来的商业性试剂盒，它用于pcr产物的克隆和测序。其原理是利用taq酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模板依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（mcs）中。
2.操作步骤
⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
⑵ 10μl体积反应体系如下：
①取t载体1μl (50ng)，加入等摩尔数pcr产物 。
②加入含atp的10×buffer 1μl，t4 dna连接酶合适单位，用ddh2o 补足至10μl 。
⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。
⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。
（二）、注意事项
1.要获得目的基因的ta克隆，pcr产物的特异性要好。
2.pcr产物在ta克隆前要通过纯化。
3.在pcr产物回收、纯化过程中防止外来dna污染。
pcr产物的ta克隆
通过pcr的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的dna序列，获得的目的片断通常需要通过ta克隆的方法，重组到t-载体中，通过序列测定清楚dna序列。由于在pcr过程中，使用的dna聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的taq酶，在pcr扩增循环结束后，加上72℃10分钟一个过程，taq酶可以在扩增产物的3末端加上a，因此pcr产物回收纯化后可以和t载体直接连接。（2）使用高保真的dna聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上a，得到的dna序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加a的过程，通常是以pcr回收产物为模板，加上一定量的普通taq酶和反应液，加入datp（或dntp）， 72℃ 10分钟，然后将加a产物直接用于ta连接。
pmd 18-t vector是一种高效克隆pcr产物 (ta cloning)的专用载体。它是takara独自研究开发，由puc18载体改建而成的。在puc18载体的多克隆位点处的xba i 和sal i识别位点之间插入了ecor v 识别位点，用ecor v进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加“t”而成。因大部分耐热性dna聚合酶反应时都有在pcr产物的3'末端添加一个“a”的特性,所以使用本制品可大大提高pcr产物的连接、克隆效率。本制品是以最为常用的puc18载体为基础研制而成，所以它具有同puc18载体完全相同的功能。此外，本制品中的高效连接液ligation solution i 可以在极短的时间内 (30分钟-1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。另外，本制品中还含有control insert (500 bp)，可用于control反应。
用途：克隆pcr产物。对克隆后的pcr产物用m13 primers进行dna测序。
α互补和蓝白筛选的原理：许多载体（包括pmd18-t）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其n端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的c端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用x-gal显色测定出来，它能将无色的化合物xgal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源dna片断插入到多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的，而没有插入外源片断的则是蓝色的。
实验内容：
试剂
pmd 18-t vector试剂盒，或自己pcr扩增回收纯化的片段，t4dna链接酶。iptg，x-gal，lb培养基等。
200mg/ml的iptg 过滤除菌
20mg/ml的x—gal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。
操作步骤
1. 在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10 ml。
pmd 18-t vector 1ml*
control insert dna 1ml*
h20 3ml
ligation solution i 5ul
l进行实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要使用适量的t载体。* 取0.5
2. 16℃反应30分钟 (过夜反应也不影响连接效率)。
l)中。3. 全量 (10ml) 转化至jm109感受态细胞 (100
4. 在含有40ml 20mg/ml的x-gal、4ml 200mg/ml 的iptg、50-100mg/ml amp的l-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
5. 挑选白色菌落，使用pcr法确认t载体中插入片段的长度大小。
注意事项：
1. ligation solution i 请于冰中融解。
2. 在进行克隆时，vector dna和insert dna的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pmd18-t vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，control insert dna 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15pmol。
3. 克隆时使用的insert dna片段 (pcr 产物) 尽量进行切胶回收纯化，pcr产物中的短片段dna(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响ta克隆的效率。
4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的dna用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化dna后再进行转化。
5. 连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状dna。
6. 连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。
7. 感受态细胞可使用适合于puc系列载体的感受态细胞，如：jm109，dh5a等。
相关问题
怎样提高pmd18-t vector的克隆效率?
1. 纯化pcr产物。切胶回收的pcr片段最好
2. 除去残存的引物等杂质。
3. dna片段的立体结构、dna片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段dna的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段dna，在使用大片段dna的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。
pcr产物难以插入载体，为什么?
1. 确认pcr反应使用的dna聚合酶在pcr产物的3'端是否附加了"a"。有些dna聚合酶扩增的pcr产物是平端,如使用本公司的pyrobest dna聚合酶 (takara code: dr005)等扩增得到的pcr产物不能直接用于ta克隆；pcr产物保存时间不要过长, 长时间保存的pcr产物会脱去末端的"a"碱基。
2. pcr产物中短片段杂质dna太多，这时应切胶回收纯化dna片段，回收时pcr产物不要在紫外线下暴露时间过长。
3. 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg puc118 dna。
4. 确认ligation solution i 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的ligation solution i 连接效率。
5. 确认抗生素的浓度是否过大。
6. 最好使用新配制的平板培养基。
转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色)，为什么?
插入的pcr片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacz基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。
插入的pcr产物进行测序时，可使用何种引物?
本制品的载体来源于puc18载体。因此，用于puc18载体测序的引物都可以使用。
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